科普干货｜实体肿瘤治疗大杀器：TCR-T细胞
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撰文｜摩西、喜宝
编辑｜南风
文章看点：
1. TCR-T分子结构与意义
2. CAR-T与TCR-T的对比
3. TCR-T治疗方法细胞的制备工艺
4. TCR-T发展趋势及挑战
CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy）疗法已经应用于临床，成为细胞治疗风云正起之时的宠儿（链接：https://mp.weixin.qq.com/s/w2k9cT0HIavj2a7RW24Usg），这种将患者的T细胞进行改造后形成的CAR-T细胞，用于治疗多种血液肿瘤，并且已经取得了较好的临床效果。
在这一波细胞治疗的浪潮中，与CAR-T并驾齐驱，被认为是实体肿瘤治疗一大杀器的是TCR-T（T cell receptor-engineered T-Cell Immunotherapy）细胞疗法，今天我们就来系统分析一下TCR-T到底是何方神圣。
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TCR-T的结构
任何一种物质形态都有它的结构。TCR（T cell receptor）属于免疫球蛋白超家族，与抗体结构相似，TCR包括α、β、γ、δ四种肽链，其中αβ型TCR的T细胞占总T细胞的绝大多数并且发挥着更加重要的作用，因此现有研究以及细胞治疗方向更多是在αβ型TCR。
TCR的α链和β链是两种多肽的异二聚体，每条链包括一个可变区结构域（V结构域）和一个恒定区结构域（C结构域），另有跨膜区。每个 V 结构域包含三个互补决定区 (CDR)，它们识别源自主要组织相容性复合体 (MHC) 上呈递的靶抗原的肽。
由于 TCR 本身不具有细胞内信号成分，因此，TCR与多个具有胞内信号传递功能的CD3亚基形成复合物（TCR-CD3 复合物）进行信号转导以激活 T 细胞。
TCR识别抗原为T细胞活化的第一信号，也是T细胞应答最为关键的一步。每一个T细胞仅拥有一种类型的TCR，因此TCR也决定了T细胞的抗原特异性。
T细胞的第二信号为共刺激分子，由抗原递呈细胞表面的共刺激分子与T细胞表面相应配体的相互作用结合，该信号确保免疫应答在需要的条件下才能发生。下图展示了TCR的主要结构，也是制备TCR-T过程中关注的主体部分。
对比CAR-T的结构，CAR-T是单链结构，通常由五个结构域组成：来自抗体的抗原结合结构域，铰链结构域，跨膜结构域，共刺激域和CD3ζ 信号域。两种细胞具体差别，可以查看下表1。
（图片来源：Engineering strategies for broad application of TCR-T - and CAR-T -cell therapies）
表1：TCR-T与CAR-T对比。（表格来源：译自Engineering strategies for broad application of TCR-T - and CAR-T -cell therapies）
CAR-T的激活依赖于“抗原-抗体”相互作用，其靶点大多局限于肿瘤细胞表面抗原。但该技术对实体瘤疗效较差、毒性较大、副作用较强。而TCR-T通过抗原特异性TCR识别肽-MHC复合物，有效靶向肿瘤细胞膜表面的肽和胞内呈递的表位肽，拓宽肿瘤免疫治疗的靶点。
此外，细胞因子风暴是CAR-T 技术在临床应用中的难以避免的头号风险，而TCR-T只介导少量细胞因子的释放，因此TCR-T细胞疗法有望大大降低细胞因子风暴的风险。
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TCR-T研究进展
（图片来源：Neoantigen-targeted TCR-T cell therapy for solid tumors: How far from clinical application）
美国国家癌症研究所肿瘤治疗领域的免疫泰斗Steven Rosenberg带领团队于2006年首次报道，使用MART-1特异性TCR-T细胞治疗黑色素瘤，客观缓解率为12%（2/17），证明了TCR-T细胞治疗在临床上的可行性应用。
2011年，该团队证实了针对NY-ESO-1的特异性TCR-T细胞对黑色素瘤和滑膜肉瘤患者的临床疗效。于2015年正式发表了完整的临床试验结果，其中滑膜肉瘤组客观缓解率为61%（11/18），黑色素瘤组客观缓解率为55%（11/20），对正常组织无毒副作用性。
高通量测序技术的发展给解码肿瘤突变带来技术突破，通过比较肿瘤与健康组织的基因，可以确定肿瘤特异性突变或体细胞突变。
2013年，Steven Rosenberg团队表明，外显子组测序可用于识别被过继转移的肿瘤反应性T细胞识别的人类肿瘤新生抗原。2014年，该团队治疗了一名患有ERBB2IP点突变的晚期难治性胆管癌患者，接受反应性的ERBB2IP特异性T细胞输入治疗后的患者肿瘤缓解，存活时间显着延长，这在学术界引起了轰动。此后，TCR-T细胞治疗的靶点向着个体化肿瘤新生抗原发展。
通过计算机更进一步模拟计算，整合多种相似性抗原的信息，也有团队试图研发在一定程度上同时识别多种抗原的多靶点反应性T细胞，增加T细胞的抗肿瘤作用。
2016年，荷兰研究人员分离的健康人群来源的T细胞，对黑色素瘤中表达的预测肿瘤新生抗原有免疫反应，这表明健康献血者的幼稚T细胞库也可以作为特异性T细胞的来源。
2019年，一项针对HPV相关上皮癌的TCR-T细胞治疗的首次人体 I/II 期研究表明，HPV16 E6 TCR-T细胞可用于难治性、转移性HPV16阳性上皮癌患者，达到肿瘤消退和客观缓解。在安全性方面，特异性TCR-T治疗既没有出现靶向自身免疫毒性，也没有出现针对健康组织的脱靶交叉反应。
肿瘤新生抗原 TCR-T细胞治疗实体瘤，如黑色素瘤、转移性结直肠癌、胶质母细胞瘤、转移性HPV16相关宫颈癌、肛门癌、口咽癌和阴道癌，已取得部分喜人的结果。
根据对近年来在美国ClinicalTrial.gov网站上注册的TCR-T临床试验的分析（截至2022 年7月），试验的靶点包括肿瘤相关抗原、肿瘤-睾丸抗原和肿瘤新生抗原抗原。其中以肿瘤-睾丸抗原临床试验最多（最多的抗原类型为NY-ESO-1）。针对病毒蛋白的临床试验涉及 EBV、HPV、HBV 和其他病毒相关蛋白。具有突变肽序列的肿瘤新生抗原特异性TCR-T临床试验包括 KRAS (G12D) 和 KRAS (G12V) 以及个体化肿瘤新生抗原靶标。
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个体化肿瘤新生抗原靶向TCR-T细胞的制备工艺
获得可以用于治疗的肿瘤新生抗原特异性TCR-T细胞，流程分为两大内容，其一是实验室检测部分，包括肿瘤新生抗原筛查，体细胞突变检测和肿瘤新生抗原反应性T细胞鉴定；其二是反应性特异性TCR-T细胞的制备和扩大培养。
（图片来源：Neoantigen-targeted TCR-T cell therapy for solid tumors: How far from clinical application）
从测序数据中检测体细胞突变和肿瘤新生抗原靶点的准确性是TCR-T治疗的关键因素。高通量测序可以提供多方面信息，尤其全外显子组测序和RNA测序的联合使用可以提高检测的准确性。但是目前测序的仍存在价格高、程序复杂、耗时长、测序深度不均匀、MHC肽预测不够准确等缺陷。此外，通过计算机模拟抗原与TCR的亲和力与实际情况存在一定的偏差，客观亲和力仍需可靠的实验验证。
在功能检测方面，需要共培养患者自身抗原递呈细胞和T细胞。通常，通过检测IFN-γ的分泌和部分共刺激信号分子的上调表明T细胞具有特异性抗原反应性，但是这两种标记都是间接证据表明T细胞的反应性，而直接使用多聚体特异性标记存在成本高、标记数量有限等问题，因此目前仍需要高敏感性、强特异性并且快捷低价的手段完成反应性T细胞的检测。进行单细胞测序后，应确定α和β链的最佳组合。
TCR的遗传修饰可以基于测序的TCR序列进行优化，以防止外源和内源TCR链的错配，增强正确配对受体的表达并增加对靶标的亲和力。目前使用的工程学方式有CRISPR/CRISPR系统、非病毒载体（睡美人转座子/转座酶）和病毒载体（逆转录病毒或慢病毒）等。
TCR-T细胞疗法的另一个技术壁垒在于快速扩增获得足够数量的细胞。传统培养技术中使用的细胞因子主要是白介素-2或者多种细胞因子构成的“鸡尾酒培养”模式。但是在培养中，来源于不同个体的细胞生长速度存在差异，而且培养期间多次更换培养容器、反复添加重要因子的操作，引入了更高的微生物污染风险。
目前较大的生物医药公司使用模块化系统和半自动化设备进行大规模制造，并且部分公司使用独立研发、造价更高的特殊培养基，以达到后续可以进行人体回输的目的。
除了制备流程中的技术问题，仍有更大的决策问题亟待解决
1）缺乏合适的肿瘤新生抗原靶点：肿瘤新生抗原的靶点问题与TCR-T细胞治疗的时间和成本密切相关。低新生抗原负荷和MHC下调降低了TCR-T治疗的敏感性。具有低突变负担（<1 个突变/Mb）的癌症，鲜有的或根本不存在新生抗原，因此无法制备肿瘤新生抗原特异性TCR-T。部分肿瘤存在MHC下调、新生抗原丢失等免疫逃逸现象，导致肿瘤细胞表面缺乏T细胞识别靶点。
2）缺乏通用的肿瘤新生抗原靶点：实体瘤的高度异质性使得很难找到通用的肿瘤新生抗原靶点，仅仅有限数量的人能受益。通过肿瘤的肿瘤新生抗原谱研究，发现肿瘤基因突变的分布非常分散，很难找到肿瘤中广泛存在的通用肿瘤新生抗原。因此，肿瘤新生抗原特异性T细胞治疗技术的临床应用仅限于病例报告，暂时不具有普遍应用价值。而缺乏通用的肿瘤新生抗原靶点也使得新生抗原抗原靶向TCR-T细胞治疗的成本高昂。
3）MHC限制将限制：MHC分子在人群中拥有极高的多样性，而且欧美针白色人种中最常见的HLA02:01进行多方面研究，而亚洲人群MHC分布更加分散，常见型别缺乏成型的细胞、动物模型等，限制了科研工作的展开，也限制了临床实验的进行。
4）免疫微环境的抑制性：免疫抑制性肿瘤微环境会抑制进入瘤内的T细胞功能。如免疫检查点分子的表达、髓系抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞的聚集、具有免疫抑制性细胞因子等肿瘤细胞和免疫抑制细胞都会有。
5）T细胞浸润组织能力差：研究表明，只有约2%的回输T细胞渗入肿瘤组织。在肿瘤细胞分泌的趋化因子和肿瘤血管内皮表达的选择素的作用下，循环T细胞在肿瘤血管内皮内滚动。然后在粘附分子的作用下，粘附并穿透血管进入肿瘤实质。肿瘤组织往往通过减少趋化因子的分泌和下调粘附分子的表达水平来影响T细胞的滚动粘附过程。此外，肿瘤组织富含基质，血管形态异常、紊乱。肿瘤微环境中免疫抑制细胞和因子的存在进一步限制了T细胞的有效渗透和浸润。
（图片来源：Neoantigen-targeted TCR-T cell therapy for solid tumors: How far from clinical application）
个体化新生抗原TCR-T细胞治疗已形成较为成熟可行的筛选和制备流程，在肿瘤新生抗原方面取得了重大进展，特别是在实体瘤方面。但在TCR-T细胞疗法临床应用前，仍有一些关键问题仍需要突破。除了个体化肿瘤新生抗原的常规筛选过程外，系统地评估实体瘤中常见驱动突变新表位的免疫原性、寻找高频肿瘤新生抗原、提高普遍性，甚至有可能在肿瘤细胞表面人工添加肿瘤新生抗原靶点都是科研人员仍在努力的方向。
在国内，已有数家企业布局研发，其中领先企业包括香雪制药（香雪精准）、恒瑞源正、优瑞科生物、药明巨诺、深圳因诺免疫、深圳宾德生物、可瑞生物等。
中国科学院广州生物医药与健康研究院携手创建联合实验室孵化了香雪精准之后，李懿教授从香雪制药争取到5年1.8亿元的资金用于国内TCR-T项目的推进。其中， TAEST16001是针对NY-ESO-1抗原的特异性TCR-T，而少量关于软组织肉瘤的人体研究也较为顺利，患者接近于完全缓解。
2021年3月获批国内首个TCR-T临床试验许可，标志着国内TCR-T细胞治疗新药研发正迈入新阶段。李懿教授根据TCR-T的特点，归纳为TCR-T的三代发展，见下表，为未来亲和力更强、效果更好的T细胞制备思路。
表2：三代TCR-T特征对比。（表格来源：精准医学会议李懿教授现场讲座）
目前TCR-T治疗仍是一种高度个性化、造价高昂的癌症疗法，不适用于绝大多数有需求的患者，并且还有一些问题需要科研人员逐个攻破。在解决技术难题的同时，如果能够进一步缩短细胞制备周期，改善肿瘤抑制性微环境，并且降低可能存在的风险，将会为TCR-T取得更好的治疗效果，成为更多患者可选的方案提供更大的舞台。
参考文献：
1 Zhao, Q. et al., Engineered TCR-T Cell Immunotherapy in Anticancer Precision Medicine: Pros and Cons. FRONT IMMUNOL 12 658753 (2021).
2 Watanabe, K. & Nishikawa, H., Engineering strategies for broad application of TCR-T- and CAR-T-cell therapies. INT IMMUNOL 33 551 (2021).
3 Bunse, L., Green, E. W. & Platten, M., High-throughput discovery of cancer-targeting TCRs. METHOD ENZYMOL 629 401 (2019).
4 Xu, R., Du, S., Zhu, J., Meng, F. & Liu, B., Neoantigen-targeted TCR-T cell therapy for solid tumors: How far from clinical application. CANCER LETT 546 215840 (2022).
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